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關(guān)于“基因表達載體構(gòu)建”的教學思考
關(guān)于“基因表達載體構(gòu)建”的教學思考
江蘇省南京市天印高級中學 倪同亮
【摘 要】一個完整的基因表達載體上除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子及標記基因等，如果目的基因自帶啟動子，是不是就不需要加啟動子呢？構(gòu)建基因表達載體時，用同一種限制酶酶切含目的基因的DNA片段和載體是不是最佳選擇？文章主要就這兩點進行分析歸納，旨在提高課堂授課效率，提升學生的應試能力。
【關(guān)鍵詞】基因表達載體；限制酶；黏性末端；平末端；啟動子；乳腺生物反應器
新課程實施已逾十年，伴隨著教與學、學與考，高中生物課程知識體系及高考的考察重點已趨于明朗化。如近幾年全國各地高考卷頻繁對選修Ⅲ“基因工程”這一知識點進行考察，尤其對“基因表達載體的構(gòu)建”這一核心步驟中所涉及的諸多問題的考查可謂層出不窮。本文從自身教學實踐出發(fā)，認為應強化以下兩點的教學：
一、關(guān)于啟動子的選擇
構(gòu)建基因表達載體的目的是使目的基因能在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用，所以在一個完整的基因表達載體上除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子及標記基因等。一個基因包含編碼區(qū)和非編碼區(qū)，啟動子位于編碼區(qū)上游非編碼區(qū)序列，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終翻譯獲得所需要的蛋白質(zhì)。那么，啟動子的選擇有要求嗎？
我們知道獲取目的基因的方法有從基因組文庫中獲取、有人工合成：如反轉(zhuǎn)錄法（cDNA文庫）、PCR、直接合成等。人工合成的目的基因往往不含啟動子、終止子等，這就必須在構(gòu)建基因表達載體時加入啟動子，否則轉(zhuǎn)錄無法啟動。問題是加入的一定是原目的基因中的啟動子嗎？另外，如果是從基因組文庫中獲取的目的基因是含啟動子的，那么，在構(gòu)建基因表達載體時，是不是就無需加入啟動子呢？
人教版選修三《現(xiàn)代生物科技專題》第21頁在講述動物基因工程應用前景時，提到用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物。將藥物蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調(diào)控組件重組在一起，通過顯微注射等方法，導入哺乳動物的受精卵中，將受精卵送入母體，使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物進入泌乳期后，可以通過分泌乳汁生產(chǎn)所需要的藥品，稱為乳腺生物反應器。請注意：基因表達載體上的啟動子并不是藥用蛋白基因自帶的啟動子，而是乳腺蛋白基因的啟動子，這也體現(xiàn)了有些啟動子具有特異性，如乳腺蛋白基因的啟動子只會在乳腺細胞中啟動基因的轉(zhuǎn)錄，從而使得藥用蛋白基因能在乳腺細胞中成功特異性表達，以此從乳汁中獲得藥用蛋白。
二、關(guān)于限制酶的選擇
在構(gòu)建基因表達載體時，其核心是將目的基因與載體結(jié)合，而結(jié)合是否符合要求，限制酶的選擇至關(guān)重要。限制酶的作用是識別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。DNA經(jīng)限制酶酶切產(chǎn)生的DNA片段通常有兩種形式——粘性末端和平末端。
人教版選修Ⅲ教科書第11頁寫到用同一種限制酶分別切割目的基因與載體，因為切割后能產(chǎn)生相同的黏性末端，末端之間能發(fā)生堿基互補配對而形成重組DNA分子，但此方法是最佳選擇嗎？ 結(jié)合近幾年高考試題和教學實踐，就限制酶選擇的優(yōu)缺點歸納如下：
1.單酶切（用同一種限制酶酶切）的優(yōu)缺點。如教材所述，用同一種限制酶分別切割含目的基因的DNA片段與載體。這是最易操作的一種方法，含目的基因的DNA片段與載體在同種限制酶作用下會形成相同的黏性末端，這兩個黏性末端通過堿基間的互補配對而連接，進而形成重組DNA分子，但存在著明顯的缺點：①酶切后的載體與目的基因在DNA連接酶作用下會發(fā)生自身環(huán)化。原因是酶切后的目的基因和載體的兩端各有一個黏性末端，這兩個末端會發(fā)生堿基互補配對而使目的基因和載體都會發(fā)生首尾相連，從而形成環(huán)狀DNA分子（載體—載體連接和目的基因—目的基因連接），甚至出現(xiàn)多個載體、多個目的基因連接而成的環(huán)狀DNA分子，這就加大了篩選的工作量。②目的基因與載體的反向連接。目的基因的插入是要有正確的方向才能正確表達（轉(zhuǎn)錄），如果載體和目的基因的酶切使用的是同一種限制酶，那么，目的基因的插入有兩種可能：一種是目的基因的最前端剛好插在啟動子下游，這樣可以正確表達；另一種剛好相反，目的基因的末端插在啟動子的下游（目的基因旋轉(zhuǎn)180度），目的基因則無法表達或表達錯誤。這兩種重組DNA分子，其中只有一種是我們所需要的，同樣也加大了篩選的工作量。
2.多酶切（用兩種或兩種以上的限制酶酶切）的優(yōu)缺點。用兩種或兩種以上的限制酶去切割含目的基因的DNA片段和載體，較常見的是用同一組兩種限制酶去切割含目的基因的DNA片段和載體，兩者都會產(chǎn)生具有兩種不同的黏性末端的DNA片段，黏性末端間通過堿基互補配對從而形成重組DNA分子。
多酶切的優(yōu)點是可以克服單酶切的兩大缺點：一是多酶切后目的基因與載體的兩側(cè)的黏性末端不相同，因此不會發(fā)生自身環(huán)化（載體—載體連接和目的基因—目的基因連接）現(xiàn)象。二是可實現(xiàn)目的基因與載體的定向連接。如緊靠啟動子下游的是EcoRⅠ位點（GAATTC），而BamH1位點（GGATTC）在后面；目的基因的前端是EcoRⅠ位點，末端是BamH1位點，酶切之后插進去，就可以保證目的基因的前端剛好插到緊靠著啟動子的下游，且只產(chǎn)生一種重組DNA，目的基因?qū)崿F(xiàn)定向插入，這樣就可以正確表達。
當然，多種酶酶切的缺點同樣存在，用多種酶切割，由于每種限制酶的最適作用條件往往不同（如最適溫度、pH值等），所以一般不能將兩種酶放在同一環(huán)境中使用，而是要進行兩次操作，需更換培養(yǎng)液，以保證酶的高效性。因此，使用多酶切的方法在實際操作中較單酶切要復雜得多。
3.慎重選擇切割出平末端的限制酶。如果備選的限制酶酶切產(chǎn)生的末端是平末端，則可用相同或不同的限制酶分別切割含目的基因的DNA片段和載體，因為即使是兩個不同的平末端，在DNA連接酶的作用下也可以任意連接。此方法的優(yōu)點不需要含目的基因的DNA片段和載體具有相同的限制酶識別序列，減少了對載體的挑選和改造的工作量。但在實踐中，極少用平末端，因為平末端的連接效率比較低，且也會出現(xiàn)目的基因—目的基因、載體—載體的自身環(huán)化現(xiàn)象及目的基因和載體的反向連接現(xiàn)象。一般只有在找不到合適切成黏性末端的酶切位點而有平末端切口的情況下才使用。
教師的教學是一個不斷積累的過程，積累來自于自身的學習、來自于高考試題的感悟、來自于學生課堂的質(zhì)疑……我們不可一成不變地照本宣書，而應該做一個發(fā)現(xiàn)者、改革者，只有這樣才能符合學生的認知規(guī)律，才能拓展學生的思維空間，才能提升學生的綜合素養(yǎng)。
參考文獻：
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[2]周荷靜。限制酶的多種切割方法及其在高考題中的體現(xiàn)[J].中學教學參考，2012,（9）。
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